|
|
Exprese a purifikace N-koncové části filamentózního hemaglutininu z Bordetella Pertussis v E. Coli
Jurnečka, David ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
: Černý kašel je vysoce nakažlivé onemocnění způsobené gramnegativní bakterií Bordetella pertussis. V průběhu infekce bakterie produkuje celou řadu toxinů a adhezivních molekul, mezi něž patří i filamentózní hemaglutinin (FHA). FHA je 220 kDa povrchový protein, jenž je také produkován ve velkém množství do média, a hraje klíčovou úlohu v interakci mezi bakterií a hostitelskými buňkami. Cílem této práce bylo vytvořit heterologní expresní systém na produkci N-koncové části B. pertussis FHA (FHA1-862) v buňkách Escherichia coli. Pro sekreci proteinu FHA1-862 do media byl vytvořen plasmid skládající se ze systému dvou nezávislých T7/Lac promotorů, první pro gen fhaB kódující FHA1-862, a druhý pro gen fhaC kódující transportní protein, jenž umožňuje přenos FHA z periplasmatického prostoru do extracelulárního média. Protein byl úspěšně sekretován v buňkách E. coli BL21 nesoucí plasmid pMM100 (LacIq ) při 30 řC a přečištěn pomocí afinitní kapalinové chromatografie na nosiči Cellufine. Tyto výsledky naznačují, že protein FHA862 může být produkován expresním systémem E. coli, nicméně tento systém poskytuje malou výtěžnost proteinu.
|
|
|
Strukturní analýza filamentózního hemaglutininu (FhaB) z Bordetella pertussis
Jurnečka, David ; Kavan, Daniel (vedoucí práce) ; Man, Petr (oponent)
: Filamentózní hemaglutinin (FHA) je adhesivní proteinová molekula, která je uvolňována gram-negativní bakterií Bordetella pertusis, způsobující infekční onemocnění zvané černý kašel (pertuse). C-koncový segment FHA hraje klíčovou roli v interakci mezi bakterií a hostitelskými buňkami, nicméně jeho struktura zůstává zatím neznámá. V této práci byla identifikována C-koncová aminokyselina FHA jako alanin v pozici 2304, zatímco C-koncová aminokyselina degradačního produktu FHA (FHA*) byla v pozici 2228. Spektroskopie cirkulárního dichroismu (CD) a nukleární magnetická resonance (NMR) ukázaly, že C-koncový fragment FHA (FHA 1995-2228) má alfa-šroubovicový charakter a netvoří definovanou terciární strukturu. Navíc, potlačení transkripce malé regulační RNA párující se k5' konci fhaB transkriptu vede k dvojnásobnému zvýšení produkce FHA. Ze získaných dat vyplývá, že C- koncový segment FHA má vlastnosti nestrukturovaných proteinů a produkce FHA je negativně regulována pomocí malé RNA. Klíčová slova: Bordetella pertussis, filamentózní hemaglutinin, malá RNA
|
|
|
Exprese a purifikace N-koncové části filamentózního hemaglutininu z Bordetella Pertussis v E. Coli
Jurnečka, David ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
: Černý kašel je vysoce nakažlivé onemocnění způsobené gramnegativní bakterií Bordetella pertussis. V průběhu infekce bakterie produkuje celou řadu toxinů a adhezivních molekul, mezi něž patří i filamentózní hemaglutinin (FHA). FHA je 220 kDa povrchový protein, jenž je také produkován ve velkém množství do média, a hraje klíčovou úlohu v interakci mezi bakterií a hostitelskými buňkami. Cílem této práce bylo vytvořit heterologní expresní systém na produkci N-koncové části B. pertussis FHA (FHA1-862) v buňkách Escherichia coli. Pro sekreci proteinu FHA1-862 do media byl vytvořen plasmid skládající se ze systému dvou nezávislých T7/Lac promotorů, první pro gen fhaB kódující FHA1-862, a druhý pro gen fhaC kódující transportní protein, jenž umožňuje přenos FHA z periplasmatického prostoru do extracelulárního média. Protein byl úspěšně sekretován v buňkách E. coli BL21 nesoucí plasmid pMM100 (LacIq ) při 30 řC a přečištěn pomocí afinitní kapalinové chromatografie na nosiči Cellufine. Tyto výsledky naznačují, že protein FHA862 může být produkován expresním systémem E. coli, nicméně tento systém poskytuje malou výtěžnost proteinu.
|
host ::
RSS.